Mecanismo de la citrato sintasa

La citrato sintasa cataliza la condensación de acetil-CoA y oxalacetato. Esta reacción inicial del ciclo del ácido cítrico es el momento en el cual los átomos de carbono se “introducen en la caldera” en la forma de acetil – CoA. La reacción de la citrato sintasa prosigue por medio de un mecanismo cinético secuencial ordenado, en el que el oxalacetato se agrega a la enzima antes que el acetil-CoA.

La estructura por difracción de rayos X de los tres dímeros de la enzima, determinada por James Remington y Robert Huber, muestra que adopta una “forma abierta” en la cual los dos dominios de cada subunidad forman una hendidura profunda que contiene el sitio de unión del oxalacetato. Sin embargo cuando se une el oxalacetato, el dominio más pequeño sufre una rotación considerable de 18 grados en relación con el dominio más grande que cierra la hendidura.

También se determinó la estructura de rayos X de dos inhibidores de la citrato sintasa en complejo ternario con la enzima y el oxalacetato.  Acetonil-CoA, un análogo inhibidor de la acetil-CoA, un análogo propuesto del estado de transición, se unen a la enzima en su forma “cerrada” y de ese modo identifican el sitio de unión de la acetil-CoA.

La presencia de las formas “abierta” y “cerrada” explica el comportamiento cinético secuencial ordenado de la enzima: el cambio conformacional inducido por la unión del oxalacetato genera el sitio de unión de la acetil-CoA, mientras sella el acceso del solvente al oxalacetato unido. Se trata de un ejemplo clásico de un modelo inducido de unión de sustrato. La hexocinasa exhibe un comportamiento similar.

La reacción de la citrato sintasa es una condensación de éster mezclada de aldol Claisen sujeta a la catálisis general ácido-base y la participación intermedia de la forma enol (ato) de la acetil-CoA. La estructura por difracción de rayos X de la enzima en el complejo ternario con oxalacetato y carboximetil-CoA revela que tres de sus cadenas laterales ionizables se orientan de manera correcta para desempeñar el papel catalítico: His 274, Asp 375 e His 320. Los dos átomos N1 en ambas cadenas laterales de His están unidos mediante uniones de  H a dos grupos NH centrales, lo que indica que estos dos átomos N1 no están protonados. La participación de His 274, Asp 375 e His 320 se confirmó mediante estudios cinéticos de enzimas mutantes generadas por estudios de mutagénesis dirigidos al sitio. El mecanismo siguiente de tres pasos formulado sobre todo por Remington justifica las siguientes observaciones:

1. El enolato de la acetil-CoA se genera en el paso de la reacción limitado por la velocidad con la participación catalítica de Asp 375 que actúa como base para quitar el protón del grupo metilo e His 274, en su forma neutra, unida por unión de H al oxígeno del enolato (cuya forma carbonilo protonada suele ser mucho mas acídica que una cadena lateral de His neutra). El pK de la forma protonado del sustrato tioéster carbonilo oxigeno aumenta a ~ 14 con la enolización, valor que se aproxima al de His 274 neutra. De ahí, se propuso que este paso se facilita por la formación de una barrera baja de uniones de hidrogeno. Sin embargo, la formación cierta de esta barrera baja de uniones de hidrogeno es tema de controversia. La presencia de la unión tioéster con la CoA facilita la enolización; la enolización del acetato requeriría sólo la formación de un intermediario de mucha mayor carga y, por lo tanto, menor estabilidad.

2. Citril-CoA Se forma en un segundo paso de reacción catalizado ácido-base en el que la acetil- CoA enolato ataca por vía nucleofílica al oxalacetato mientras que His 320, también en su forma neutra, cede un protón al grupo carbonilo del oxalacetato. Citril-CoA permanece unido a la enzima.

3. Citril-CoA se hidroliza a citrato, y CoA con His 320, ahora en forma aniónica, sustrae un protón del agua mientras ataca al grupo carbonilo de citril-CoA y la forma acídica de Asp 375 cede un protón a CoA mientras desaparece. Esta hidrólisis provee a la reacción con la energía termodinámica necesaria (-31,5 Kj/mol).

  

Las reacciones catalizadas por enzimas, son estereoespecíficas. La condensación del aldol-Claisen que se observa aquí, involucra el ataque del acetil-CoA enolato con exclusividad en la cara si del átomo de carbono del grupo carbonilo del oxalacetato y, de ese modo, se obtiene (S)-citril-CoA. Así, el grupo acetilo de la acetil-CoA forma el grupo carboximetilo pro-S del citrato.

Bibliografía

Donald Voet, Judith G. Voet, Charlotte W. Pratt.
Fundamentos de Bioquímica. La vida a nivel molecular.

2ª Edición.